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Preparación de Suspensión Celular

  1. Tratamineto hipotónico
    El tratamiento hipotónico es crítico para la propagación cromosómica. Las incubaciones hipotónicas demasiado largas o demasiado cortas conducen a una propagación inadecuada y una calidad de bandas o hibridación deficiente. Para el tratamiento hipotónico de linfocitos de sangre periférica, se recomienda incubar las células en KCl 0,075 M a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  2. Lavando celular

    Después de la incubación hipotónica, las suspensiones celulares deben lavarse varias veces en solución de fijación fresca (metanol: ácido acético = 3:1). Para que el lavado sea más fácil y rápido, las células se pueden transferir a viales de 1,5 microcentrífugas. Después del lavado, centrifugar las células a 6000 rpm durante 1-2 minutos para recoger las células.

  3.           Almacenamiento

    Las suspensiones celulares se pueden almacenar en viales de microcentrífuga de 1,5 ml o 2,0 ml llenos de fijador a -20°C durante varios años.
Preparacioón de Diapositivas
  1. Tratamiento de diapositivas    
    Los portaobjetos previamente limpiados comercialmente no requieren pasos de limpieza adicionales antes de su uso. Si los portaobjetos no se limpiaron previamente, límpielos sumergiendo el portaobjetos / cubreobjetos en acetona, HCl, ácido acético y agua antes de usarlos. 
  2. Volumen de caída celular
    Se puede colocar una suspensión celular de 10-20 ul en un portobjetos usado una pipeta de 200ul. 
  3. Cayendo desde una altura
    No es necesario.
  4. Métodos para controlar el grado de propagacíon 
    La propagacíon del cromosoma se produce en el momento en que la superficie de fijación, a medida que se evapora, entra en contacto con las superficies celulares esféricas. Este es el momento crítico para intervenir para aumentar o disminuir el grado de propagacíon. Se pueden usar vapores de agua, calor o concentraciones variables de ácido acético.
  5. How to reduce the influence of the atmospheric humidity
    After dropping cell suspension on the slide, the fixative evaporates. When the surface of the slide becomes grainy, put the slide face-down in the steam of a hot waterbath for 1-3 seconds, and then let the slide dry at room temperature. The hot steam will reduce the influence of the atmospheric humidity. 
  6. Slide aging
    The slides should be aged at 37°C for 1-2 day before use. Over-aged metaphase spread may result weak and unspecific signals. It is not recommended to use slides aged at 37°C longer than 1 week.
Desnaturalizacíon e Hibridación
  1. Slide denaturing
    Metaphase spread slides should be denatured in denaturing solution for 5 minutes at 75℃ followed by dehydrting in 70%, 85% and 100% ethanol 1 min each. Over-aged slides need more time for denaturing. 
  2. Probe denaturing
    The probe should be denatured 5 minutes at 75℃ followed by cooling at room temperature. Probe pre-annealing is not essential. 
  3. Hybridization chamber
    To prevent the slides from drying during hybridization, place the slide in a moist hybridization chamber. Extra water below the slides does no harm but will be helpful to the hybridization when the coverslip sealing is incomplete.

 

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