Hibridación Fluorescente in Situ (FISH)

La hibridación in situ (ISH) es una técnica poderosa diseñada para detectar la presencia o ausencia, ubicación, integridad y cantidad de secuencias de ADN o ARN en tejidos, células o cromosomas. ISH se basa en la detección de secuencias específicas mediante el emparejamiento de bases (hibridación) en cadenas simples complementarias de ácido nucleico. Aquí, una de las cadenas es un fragmento de secuencia marcada (sonda) que se une solo a aquellas partes del genoma con una secuencia altamente o completamente complementaria, y la otra cadena está presente en el material de la muestra que se analizará. En consecuencia, la hibridación in situ comienza con la preparación de la muestra a analizar y con la preparación de la sonda. El ADN típicamente bicatenario en la muestra tiene que fundirse (desnaturalizarse) en cadenas individuales, y la sonda debe marcarse para permitir la detección.

Los pasos básicos para ISH se desarrollaron en la década de 1960 utilizando isótopos radiactivos para la detección de sondas. A principios de la década de 1980, se han desarrollado protocolos que usan tintes fluorescentes para la visualización de la sonda. Debido a que estas etiquetas son más seguras, más estables y más fáciles de manejar, la gran mayoría de la hibridación in situ hoy en día se realiza utilizando protocolos de fluorescencia ISH (FISH). Otra ventaja importante de FISH es que permite, al usar varios tintes fluorescentes diferentes, la detección simultánea de diferentes estructuras objetivo dentro de una sola muestra.

FISH se ha convertido en una herramienta citogenética central. Los fragmentos de la sonda pueden derivarse de varias fuentes, por métodos recombinantes o por PCR. Hoy en día, los cromosomas artificiales bacterianos mapeados con precisión (BAC) son el tipo de sonda más utilizado. Diseñar o seleccionar la sonda adecuada para FISH a menudo requiere un equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad, es decir, una sonda debe ser lo suficientemente grande como para asegurar una unión específica y llevar una cantidad suficiente de etiqueta para la detección. Por otro lado, al aumentar la longitud de la sonda, también aumenta la posibilidad de hibridación con secuencias diana adicionales. Además, si una sonda es demasiado larga, puede provocar una señal grande o difusa.

El etiquetado de la sonda se puede hacer uniendo moléculas fluorescentes directamente a la sonda o marcando la sonda con conectores antigénicos o químicos que luego se unirán a los fluoróforos. Dependiendo del protocolo que se use, el proceso puede llevar desde unas pocas horas hasta unos pocos días. Se llama "in situ" para enfatizar el hecho de que la detección del ácido nucleico diana ocurre no en moléculas aisladas en tubos de ensayo, sino directamente en células o tejidos frescos o fijos.

Con FISH, los reordenamientos cromosómicos o las aberraciones de tan solo unos pocos pares de megabase (millones de pares de bases) pueden hacerse visibles en los cromosomas metafásicos (condensados). La resolución se reduce a aproximadamente 1Mb para los cromosomas de interfase (dispersos). Se puede lograr una resolución aún mayor con métodos desarrollados recientemente que abarcan el estiramiento artificial de las fibras de cromatina.

Los métodos FISH no pueden detectar mutaciones de nivel base, p. Las mutaciones puntuales subyacentes a algunos trastornos hereditarios. Sin embargo, las técnicas de FISH han hecho contribuciones importantes para acercar los mapas genéticos y físicos del genoma humano.

 En la investigación, FISH se utiliza para identificar la posición de los genes, determinar el número y la integridad de los cromosomas humanos, para el cariotipo y la pintura cromosómica. En el laboratorio clínico, FISH se ha convertido en una herramienta estándar para detectar aberraciones cromosómicas, particularmente en el diagnóstico prenatal y de cáncer. Las sondas y protocolos FISH para muchos genes han sido validados analítica y clínicamente, y se están desarrollando y probando muchos más.