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细胞悬液的制备

  1. 低渗处理
    低渗处理对于染色体伸展十分关键。低渗孵育太长或太短均可导致染色体伸展不充分、条带不明显或杂交质量不佳。对于外周血淋巴细胞的低渗处理,建议将细胞在室温条件下于0.075MKCl中孵育15分钟。 
  2. 细胞清洗
    低渗孵育后,细胞悬液用新鲜固定液(甲醇:乙酸=3:1)清洗几次。为使清洗更方便快捷,可将细胞转移到1.5mL微量离心管中。清洗后,以6000rpm离心2分钟,收集细胞。 
  3. 保存
    细胞悬液可在充满固定剂的1.5mL或 2.0mL微量离心管中于-20℃下保存几年。
 
载玻片的制备 
  1. 载玻片处理
    商业化预清洗载玻片在使用前无需进行额外清洗。如果载玻片未进行预清洗,使用前,将载玻片/盖玻片浸泡在丙酮、盐酸、乙酸和水中,清洗载玻片。 
  2. 细胞滴液体积
    用200μL移液器,将10-20μL细胞悬液滴于载玻片上。 
  3. 从一定高度滴液
    无需。 
  4. 控制伸展度的方法
    当固定剂挥发,固定剂表面接触球形细胞表面时,染色体伸展。这是增加或减少伸展度的关键时机。可使用水蒸汽、加热或不同浓度的乙酸。 
  5. 如何减少空气湿度的影响
    将细胞悬液滴于载玻片上后,固定剂挥发。当载玻片表面形成微粒状时,将载玻片面朝下,于热水浴蒸汽中放置1-3秒,然后,让载玻片室温干燥。热蒸汽将减少空气湿度的影响。 
  6. 载玻片老化
    使用前,载玻片应在37℃老化1-2天。过度老化的中期细胞染色体可能产生微弱的非特异性信号。不建议将载玻片于37℃下老化超过1周。
 
变性和杂交
  1. 载玻片变性
    中期细胞的载玻片应在变性溶液中于75℃变性5分钟,接着用75%、85%和100%乙醇分别脱水1分钟。过度老化载玻片需要的变性时间更长。 
  2. 探针变性
    探针应在75℃变性5分钟,接着室温冷却。无需进行探针的预退火。 
  3. 杂交盒
    为防止载玻片在杂交过程中变干,将载玻片置于加湿杂交盒中。载玻片下额外的水没有影响,且有助于在盖玻片未完全密封时的杂交。

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