石蜡包埋组织切片的荧光原位杂交(FISH)步骤

试剂

• 石蜡前处理试剂盒
  • 前处理溶液（1N 硫氰酸钠）：室温保存
  • 胃蛋白酶（活性1:3000 到1:3500）：冻干，保存在-20°C
  • 胃蛋白酶缓冲液（氯化钠溶液，pH2.0）：室温保存
  • 清洗缓冲液（2XSSC，pH 7.0）：室温保存
• 二甲苯：室温保存
• 乙醇（100%）：室温保存
• 中性福尔马林缓冲液（4%甲醛，溶于PBS）
• 浓盐酸（12N）
• 1N氢氧化钠
• 超纯甲酰胺：详细信息参见生产商的建议
• 20XSSC盐：室温保存，防潮
• NP-40：室温保存
• DAPI复染剂：4°C暗处保存
• 纯水

工作液的制备 

20XSSC溶液： 将20g 20XSSC粉末溶于200mL纯水。加纯水使总体积达到250mL。用浓盐酸调节pH值为5.3。该溶液在室温保存，可达6个月。

变性溶液（70%甲酰胺/2XSSC，pH 7.0-8.0）： 将49mL甲酰胺和7mL 20XSSC混合，加入纯水使总体积达到70mL。盖紧容器盖，并于2-8°C保存。该溶液可在1周内使用。每次使用前，检查pH值，应在7.0-8.0范围内。

胃蛋白酶溶液： 验证胃蛋白酶缓冲液的pH值，应为2.0。37°C预热50mL 蛋白酶缓冲液。将25mg蛋白酶溶于蛋白酶缓冲液。每次现用现配。

乙醇溶液： 用100%乙醇和纯水，制备v/v为70%、85%和100%的乙醇溶液。盖紧容器盖，室温保存。稀释液可在1周内使用，除非溶液蒸发或者溶液由于过度使用而变稀。

杂交后清洗缓冲液（2XSSC/0.3% NP-40）： 混合3mL NP-40和100mL 20XSSC。加纯水使总体积达到1000mL。用1N氢氧化钠将pH值调节到7.0-7.5。每天弃去用过的溶液，室温保存未用溶液，可达6个月。

石蜡包被组织切片的荧光原位杂交（FISH）步骤 

载玻片前处理

1. 室温条件下，将载玻片浸入二甲苯中，持续10分钟。重复两次，每次使用新二甲苯。
2. 室温条件下，采用100%乙醇将载玻片脱水。使用新100%乙醇重复一次。
3.  空气干燥载玻片，或者将载玻片放在45-50°C的载玻片温箱中干燥。
4. 室温条件下，将载玻片浸入0.2N盐酸中，持续20分钟。
5. 室温条件下，将载玻片浸入纯水中，持续3分钟。
6. 室温条件下，将载玻片浸入清洗缓冲液中，持续3分钟。
7. 80°C时，将载玻片浸入预热的前处理溶液中，持续30分钟。
8. 室温条件下，将载玻片浸入纯水中，持续1分钟。
9. 室温条件下，将载玻片浸入清洗缓冲液中，持续5分钟。使用新清洗缓冲液重复一次。
10. 37°C时，将载玻片浸入预热的胃蛋白酶溶液中，持续10-60分钟。
11. 室温条件下，将载玻片浸入清洗缓冲液中，持续5分钟。使用新清洗缓冲液重复一次。.
12. 45-50°C载玻片温箱中，干燥载玻片，持续2-5分钟。
13. 室温条件下，将载玻片浸入中性缓冲福尔马林中，持续10分钟。
14. 室温条件下，将载玻片浸入清洗缓冲液中，持续5分钟。使用新清洗缓冲液重复一次。
15. 45-50°C载玻片温箱中，干燥载玻片，持续2-5分钟。 

探针的制备

1. 室温条件下，回温探针，持续20-30分钟。
2. 简单涡旋并离心。 

载玻片变性和杂交

1. 72°C时，将载玻片浸入预热的变性溶液中，持续5分钟。
2. 室温条件下，将载玻片浸入85%乙醇中，持续1分钟，同时搅拌，接着，将载玻片浸入100%乙醇中，持续1分钟。
3. 在45-50°C的载玻片温箱中，干燥载玻片，持续2-5分钟。
4. 将10 μL 探针混合物放在每个杂交区域，用 22 mm x 22 mm 的盖玻片盖上。用橡胶胶水密封。
5. 将载玻片放在预热加湿杂交箱中，37°C过夜温育载玻片（14-18小时）。

杂交后清洗

1. 用金刚石尖笔在载玻片背面标记杂交区域。
2. 小心除去橡胶胶水。
3. 室温条件下，将载玻片浸入杂交后清洗缓冲液中，使盖玻片的贴附力变小。轻轻摇动，去除盖玻片；不得强力拔下盖玻片。
4. Immerse slides in pre-warmed Post-Hybridization Wash Buffer at 72°C for 2 minutes.
5. 于暗处，自然干燥载玻片。
6. 加DAPI复染剂，用盖玻片盖上载玻片。
7. 采用带有正确滤光片的荧光显微镜检查载玻片。