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荧光原位杂交(FISH)

原位杂交(ISH)是一种功能强大的技术,可用于检测组织或细胞中染色体上的DNA或RAN序列的存在、缺失、定位、完整性和数量。ISH基于互补核酸单链的碱基配对(杂交)检测特异序列。在这种技术中,一条链是标记的序列片段(探针),仅与基因组中与之高度或者完全互补的序列结合,另一条链存在于待分析的样本材料中。因此,原位杂交始于制备分析用的样本和探针。将样本中的典型双链DNA变性成单链,并需要对探针进行标记以便于检测。

19世纪60年代开发了ISH的基本步骤,采用放射性同位素进行探针检测。19世纪80年代初,开发了采用荧光染料进行探针可视化的方法。因为这些标记更安全、更稳定、更易于处理,今天,大多数的原位杂交采用FISH方法。FISH的另一个重要优点是:通过采用几种不同的荧光染料,可同时检测单个样本中的不同靶结构。

FISH已成为细胞遗传学的一种重要技术。探针片段有多种来源:通过重组方法,或者通过PCR。今天,最常用的探针类型是经准确构建的细菌人工染色体(BAC)。设计或选择合适的FISH探针往往需要在灵敏度和特异性之间取得平衡,即,一个探针必须足够大,以确保特异性结合,以及携带足够数量的标记进行检测。另一方面,随着探针长度的增加,探针与其他靶序列杂交的可能性也增加。此外,探针如果太长,可能产生较大的信号或弥散性信号。

可直接将荧光分子与探针连接,或者用抗原或化学基团标记探针,抗原或化学基团随后与荧光基团结合,完成探针标记。根据使用的方法,标记过程可能从几个小时到几天不等。称为“原位”是为了强调如下事实:不是检测试管中分离的靶核酸分子,而且可直接检测新鲜或固定细胞或组织中的靶核酸分子。

采用FISH技术,可直观地观察中期(凝集)染色体上的染色体重排或小到几兆碱基对(百万个碱基对)的畸变。对于间期(伸展)染色体而言,分辨率可达到约1Mb。最近开发的几种方法,涉及染色质丝的人工伸展,甚至能达到更高的分辨率。

FISH方法无法检测碱基水平的突变,例如,一些遗传性疾病潜在的点突变。然而,FISH技术具有里程碑式的贡献:它使基因和人体基因组的物理图谱紧密联系起来。

在研究领域,FISH可用于鉴定基因的位置、确定人体染色体的数目和完整性,以进行人体染色体核型分析和染色体涂染。在临床实验室,FISH已成为检测染色体畸变的一种标准工具,特别在产前和癌症诊断方面。目前许多基因的FISH探针以及操作已获得了分析和临床验证,更多的正在开发和检测中

 

 

 

 

 

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